Teave

DNA sekveneerimise probleem


Kõigepealt lubage mul probleemi kirjeldada:

Teie labor on välja töötanud meetodi DNA replikatsiooni uurimiseks rakuekstraktis. Rakulisele valguekstraktile lisate sünteesitud DNA visualiseerimiseks nukleotiide, väikese koguse radiomärgistatud 32P-dGTP-d ja 4000-aluselise paari lineaarse kaheahelalise DNA molekuli, mille keskel on replikatsiooni alguspunkt. Pärast seda, kui olete lasknud reaktsioonil 30 minutit temperatuuril 30 ° C jätkuda, keedate segu valkude ja DNA ahelate denatureerimiseks, eraldate komponendid akrüülamiidgeelil ja tuvastate radioaktiivselt märgistatud DNA tooted. See täielik reaktsioon on näidatud alloleval joonisel geeli rajal 2.

Probleem A:

Teete analüüsi esimest korda ise ja keegi ei ole laboris. Tuubis, millel on märge „nukleotiidide segu”, piisab ainult ühe reaktsiooni jaoks, kuid leiate toru, millel on silt „dATP, dTTP, dGTP, dCTP” ja kasutate seda teises reaktsioonis. Leiate, et esimene reaktsioon näeb välja nagu rada 2 ja teine ​​reaktsioon näeb välja nagu rada 3. Miks ei sünteesitud teises reaktsioonis DNA -d?

Minu vastus:

Kuna desoksüriboosi trifosfaatidel ei ole -OH rühma kinnitamiseks. Nendega ei saa sisuliselt ehitada.

Probleem B:

Teie laboripartner on hiljuti isoleerinud mutantse tüve, mis suudab 30 ° C juures tavaliselt oma DNA -d kopeerida, kuid 40 ° C juures DNA replikatsiooni ei esine. Ta nimetab mutanti tsr1, temperatuuri tundlikuks replikatsiooniks. Metsikut tüüpi tüvi kordub tõhusalt mõlemal temperatuuril. Usute, et saate rakuekstraktide biokeemilise analüüsi abil tuvastada, millised geenid on mutandis defektsed. Kasvatate metsiktüüpi rakke ja tsr1 rakke temperatuuril 40 ° C, valmistate ekstrakte, inkubeerite DNA replikatsioonireaktsiooni temperatuuril 40 ° C ja tuvastate tooted geelil. Te jälgite mustrit, mis on näidatud radadel 4 ja 5. Te olete tulemustest nii elevil, et jooksete oma laboripartneri juurde ja ütlete talle, et teate, milline ensüüm on vigane. Ta on teie tulemustest rõõmus, kuid ütleb, et on kolm erinevat ensüümi, mis võivad teie tulemusi arvesse võtta. Mis need on?

Olen selles osas 100% eksinud.

Jooniselt saan aru, et metsikut tüüpi 40 kraadi juures on 4000 nukleotiidi, nii et seda ei lõigata ära. Mutant trs1 lõigatakse kaheks 2000. aasta viiluks ja üks neist viiludest lõigatakse viiludeks 500? Kas ma saan sellest õigesti aru? Samuti ei saa ma aru, miks 500 joon on teistega võrreldes nii paks?

Igatahes tunnen end selles suhtes väga segaduses. Olen õppinud Sangeri sekveneerimise kohta ja see on 100% mõistlik, kui segusse on lisatud ddXTP, et vaadata iga jada pikkust ja seega ka järjestust lugeda, kuid ma pole isegi kindel, kas see siin nii toimub.


Kuigi teie - või probleem ei selgitanud - eeldan oma vastuses, et töötate eukarüootsüsteemiga, kuigi replikatsiooni põhimõte on sama.

dNTP-de 3. süsinikuaatomil on OH-rühm (nt kontrollige dCTP-d sellelt wiki-lehelt), nii et ma ei usu, et see on siin probleem. Ma arvan, et esimene toru sisaldab raadio märgistusega GTP ja teine ​​mitte, nii et isegi DNA on olemas, te ei näe seda - kuigi küsimus küsis konkreetselt, miks DNA -d ei sünteesitud, on minu arvates see keeruline küsimus et teid segadusse ajada.

Teise probleemi puhul peame natuke uurima replikatsiooniprotsessi:

Replikatsioonikahvlis sünteesitakse kaks ahelat erinevalt. Niinimetatud juhtketti tehakse pidevalt, ilma katkestusteta, kuid teine ​​ahel - nn mahajäänud ahel sünteesitakse väikeste fragmentide - ehk Okazaki fragmentide - ligeerimise teel. Need väikesed fragmendid vajavad oma RNA praimereid, mis tuleb pärast sünteesi lõpetamist eemaldada. Kuna replikatsiooni alguspunkt on keskel ja replikatsioon võib toimuda mõlemat pidi, saate sellise lineaarse fragmendi puhul nagu teie oma kahest 2000 bp fragmendist kahest juhtkihist. Kas see oleks ümmargune DNA, siis võite ikkagi saada 4 kbp fragmente, kuna replikatsioon võib DNA ringi ümber käia. Väiksemad 500 bp fragmendid, mida tsr1 sõidurajal on üsna palju, on fragmendid, mida ei saa ligeerida. Seda öeldes pean tunnistama, et 500 bp Okazaki fragmendid oleksid eukarüootide jaoks ebatüüpilised (tavaline on umbes 100–200 bp). Seega võivad selle eest vastutavad ensüümid olla:

DNA ligaas - vastutav mahajäänud ahela fragmentide ligeerimise (ühendamise) eest. Delta polümeraas (Pol δ): see vastutab ahela mahajäämuse ja praimeri eemaldamise eest - sel juhul võib praimeri eemaldamise funktsioon olla vigane, mistõttu praimerid jäävad DNA -le ning täielik süntees ja ligeerimine ei saa toimuda. Viimane valk, kuigi see pole päris ensüüm, on DNA klambrikompleks (PCNA). See kompleks stabiliseerib polümeraasi DNA -ks, kuid eelmise fragmendi saavutamisel peaks polümeraas dissotsieeruma. Kuid kui klamber on düsfunktsionaalne, jääb polümeraas fragmendi otsa kinni, seega ei saa praimerit eemaldada ja ligeerida.

Kui vajate lisateavet, lugege seda wiki-lehte.


DNA sekveneerimise vead

Tere bioloogia redaktorid, olen viimasel ajal huvi tundnud DNA järjestamise vastu ja leidsin selle (suhteliselt) odava DNA järjestuse, kuid pärast mõningast kaevamist leidsin, et selle täpsus on vaid 75%, miks peaks keegi isegi harrastusteadlane seda kasutama kui tulemust ei saa usaldada?

Järjekord ikka ja jälle. Niikaua kui vead on juhuslikud, minimeerite nende lõplikku mõju kordamisega.

Seda tüüpi sekventeerijaid on teie antud põhjusel tõepoolest vaieldud, kuid nüüd tundub, et see töötab hästi. See on lihtne ja kaasaskantav ning kulutõhus.

Tänan! Aga kuidas saaksite oma lõpliku DNA -järjestuse? Kui ma teeksin näiteks 10 sama DNA testi, saaksin kirjutada tarkvara, mis võrdleks tsütosiini/guaniini/adeniini/tümiini ahela positsiooni suhtes ja kasutaks seda, mis on kõigis 10 järjestuses kõige silmapaistvam. Kuid kuna kõik testitud kiud ei ole vigade tõttu tõenäoliselt sama pikkusega, ei tööta see meetod tegelikult. On ideid, kuidas seda parandada? Ja ma teen!

Muud huvitavad küsimused on 'mille ' ja ' kus ' saab kasutada. Kuna baastäpsus on nii madal, ei kasutata seda tõenäoliselt inimese geneetilise variatsiooni uurimiseks, kuid pidage meeles, et näidud on üsna pikad, nii et tõenäoliselt saate väiksemate genoomide, näiteks bakterite ja viiruste korral hea katvuse. Lisaks saab kaasaskantavaid seadmeid kasutada piirkondades, kus laboriga pole otsest ühendust. Näiteks on seda kasutatud Lääne-Aafrikas kohapeal ebola proovide analüüsimiseks (rohkem rakendusi: 10.1186/s13059-016-1103-0). P. S. Ma ei ole kuidagi ettevõtte või artikliga seotud.


DNA sekveneerimise tõrkeotsingu juhend

Automatiseeritud DNA sekveneerimine on üks levinumaid ja tavaliselt kõige vastupidavamaid meetodeid, mida tehakse molekulaarbioloogilistes laborites. Kahjuks ei tööta see alati ja kui see ei tööta, võib valesti selgitamine olla väga raske. Õnneks on enamikul ebaõnnestunud (või mitteoptimaalsetel) DNA sekveneerimise tulemustel vaid piiratud arv põhjuseid. DNA sekveneerimisprobleemide tõrkeotsingu hõlbustamiseks oleme loonud juhendid kõige levinumate põhjuste väljaselgitamiseks. Need juhendid sisaldavad ka näpunäiteid iga probleemitüübi ületamiseks ning üldisemaid näpunäiteid DNA järjestamise kvaliteedi parandamiseks.

Kui teil on nende juhendite kohta kommentaare või küsimusi, võtke ühendust meie tugitiimiga aadressil nagu me tahaksime kuulda teie ettepanekuid.

Kuidas tuvastada DNA järjestamise ebaõnnestumiste põhjuseid

Halva DNA sekveneerimise tulemuse põhjuse väljaselgitamine võib sageli olla väga raske, kuna konkreetsel sekveneerimisprobleemil võib olla palju erinevaid põhjuseid või see võib olla tingitud mitmetest interakteeruvatest teguritest. Sageli on ainus viis konkreetse probleemi tegeliku põhjuse väljaselgitamiseks kõrvaldamisprotsess.

Seda protsessi saab oluliselt lihtsustada, visuaalselt uurides sekveneerimisjälgede töötlemata ja töödeldud andmete kromatogramme. Järgmises juhendis oleme esitanud üksikasjaliku teabe kõige sagedamini täheldatud järjestamisprobleemide kohta koos soovitustega nende kõige tõenäolisemate põhjuste kohta. Põhjused on loetletud järjekorras, alates kõige tavalisemast kuni kõige vähem levinud. Oleme lisanud ka lahendused (kui need on teada) iga järjestamisprobleemi tüübi ületamiseks.

Alternatiiv käsitsi kontrollimisele (mis muutub väga töömahukaks, kui kasutate rohkem kui mõnda jälge) on kasutada automatiseeritud jälgimisanalüüsi süsteemi, nagu meie QualTrace III DNA järjestamise QC tarkvara. QualTrace III skaneerib automaatselt jälgi paljude erinevate sekveneerimisprobleemide jaoks ja kuna see töötab algandmeid analüüsides, saab seda kasutada mis tahes baaskutsujaga.

Et näha, kuidas QualTrace III võib aidata meie loodud DNA sekveneerimise tõrkeotsingul a QualTrace III tasuta veebiversioon kuhu saate oma jäljed üles laadida ja omada QualTrace III analüüsige neid võimalike probleemide suhtes.

Kõige tavalisemad automatiseeritud DNA järjestamise probleemid

Järgmised juhendid toovad näiteid Sangeri DNA sekveneerimisprobleemide peamistest põhjustest, kirjeldavad, kuidas neid tuvastada ja põhiprobleeme lahendada.


Loeng 2: Bioloogia taust, esimese ja teise põlvkonna järjestamine

Kirjutas Claire Margolis ja muutis kursuse töötajad

Teemad

Selles loengus arutame, kuidas sekveneerimisprotsess teatud peavoolu tehnoloogiate puhul toimib. Esmalt tutvustame mõnda bioloogilist tausta. Seejärel tutvustame ja arutame kahte peamist sekveneerimistehnoloogiat: Sanger (esimese põlvkonna sekveneerimistehnoloogia) ja Illumina (teise põlvkonna sekveneerimistehnoloogia).

DNA põhitõed

Inimene genoom on kogu inimese DNA järjestus. Inimese DNA sisaldab 23 paari kromosoome ja iga paar sisaldab ühte emalt päritud ja isalt päritud kromosoomi, saades kokku 46 kromosoomi. Paaridest 22 on autosomaalsed kromosoomid ja viimane paar on sugukromosoomid. Iga organismi rakk sisaldab samu täpseid genoomseid andmeid, mis elavad raku tuumas. Inimestel on genoom 3 miljardit aluspaarid (bp) pikk. Erinevatel liikidel on väga erineva suurusega genoomid. Bakterite genoomid on paar miljonit bp, enamik viiruse genoome on 10000 bp ja teatud taimede genoomid on sadu miljardeid bp. Rakke on kahte tüüpi: prokarüootsed (tuuma pole ja neid leidub sellistes organismides nagu bakterid) ja eukarüootsed (sisaldab tuuma ja leidub kõrgemates organismides nagu inimesed). Kuigi inimese genoomi mõistmine on oluline, on selle klassi meetodid üldjoontes rakendatavad ka teistele organismidele.

Inimeste genoomid on umbes 99,8% sarnased. 3 miljardist aluspaarist varieeruvad üksikud genoomid 3-4 miljoni aluspaari asukohas. Need variatsioonid on jäädvustatud üksikute nukleotiidide polümorfismidesse (SNP), kuigi on ka mõningaid suuri variatsioone, mida nimetatakse struktuurivariantideks (SV). Üksikute genoomide erinevused tekivad kahel põhjusel:

  1. Juhuslikud mutatsioonid, mis tekivad evolutsiooni käigus, sest looduslik valik soosib teatud fenotüüpe. Need tekivad peamiselt "vigade" tõttu DNA replikatsiooniprotsessis rakkude jagunemise ajal. Enamik neist mutatsioonidest on kahjulikud, põhjustades fenotüüpilisi muutusi, mis on kahjulikud ja põhjustavad raku surma. Aeg -ajalt soosib looduslik valik teatud mutatsioone ja need säilivad populatsioonis.
  2. Rekombinatsioon, mis toimub paljunemise ajal kõrgetel organismidel, näiteks imetajatel. Rekombinatsiooni ajal on geneetiline materjal, mille emaorganismid oma lapsele edastavad, vanemate segu.

DNA struktuur

DNA koosneb suhkru-fosfaadi karkassist ja neljast nukleotiidalusest: adeniin (A), tsütosiin (C), guaniin (G) ja tümiin (T). DNA on kaheahelaline ja struktureeritud kahekordse spiraali moodustisesse, kus spiraali „astmetena” on nukleotiidipaarid (siit ka termin „aluspaar”). Adeniin seondub alati keemiliselt tümiiniga ja tsütosiin alati guaniiniga. Teisisõnu, A on täiendavad kuni T ja samamoodi täiendab C G.-d. A-T ja C-G paarid on tuntud kui täiendavad paarid. DNA struktuur on näidatud allpool.

DNA järjestus kirjutatakse tavapäraselt 5 ’otsa (pea) kuni 3’ otsa (saba) suunas. Kui kirjutame DNA ahelat, kirjutame ainult ühe ahela aluseid tähistavad tähed. Teine suund, mis on vastupidine täiend esimese ahela kohta, võib järeldada, sest me teame komplementaarseid paare. Pöördkomplemendi saamiseks pöörame algse stringi nukleotiidide järjekorra ümber ja täiendame seejärel nukleotiide (st vahetame A -ga T ja C -ga G). Alloleval joonisel on näidatud DNA fragment ja selle pöördkomplemendi ahel.

DNA replikatsioon

DNA on rakkude replikatsiooni alus. Kui rakk läbib rakkude jagunemist, tuntud ka kui mitoos, selle tuumas olev DNA replitseeritakse ja läbi alloleval joonisel näidatud sammude seeria annab üks vanemrakk kaks identset tütarrakku.

Mitoosi ajal on kaasatud mitmeid biomolekule ja me anname siin mitootilise protsessi väga lihtsustatud selgituse. Joonisel alustame kahest kromosoomist: punane ja sinine. Esiteks replitseeritakse DNA, mille tulemuseks on tuttavamad X-kujulised kromosoomid. Biomolekulaarsete signaalide keeruka kaskaadi ja rakusisese ümberkorraldamise kaudu on (nüüd korduvad) kromosoomid paigutatud raku keskele. Iga kromosoomi puhul tõmmatakse pooled üksteisest eemale ja mõlemad tütarrakud saavad algse kromosoomi koopia. Selle tulemuseks on kaks tütarrakku, mis on geneetiliselt identsed algrakurakuga. Meie jaoks on DNA dubleerimine selle diagrammi kõige olulisem osa, see on loomulik protsess, mida me sekveneerimiseks kasutame.

DNA replikatsiooni ajal pakitakse kaks DNA ahelat kõigepealt lahti, mille tulemusel toimivad kaks üksikut ahelat kumbki replikatsiooni mallina. Seejärel kinnitatakse DNA spetsiifilisele saidile lühike RNA praimer, praimeri alused täiendavad saidi aluseid. Ensüüm hõlbustab (või “katalüüsib”) keemilist reaktsiooni ja DNA polümeraas on ensüüm, mis katalüüsib uute nukleotiidide komplementaarset sidumist matriitsi DNA -ga, mis pikendab seotud praimerit. Nukleotiide, mida DNA polümeraas kasutab ahela pikendamiseks, nimetatakse dNTP -d (deoksünukleotiidtrifosfaadid). Biokeemiliselt erinevad need nukleotiididest veidi viisil, mis hõlbustab nendega töötamist DNA replikatsiooni ajal. A, C, G ja T vastavad dNTP -d on vastavalt dATP, dCTP, dGTP ja dTTP. DNA replikatsiooni on illustreeritud allpool.

Sangeri järjestamine

Esimene meetod, mida kasutati DNA -st lugemiste saamiseks, oli Sangeri sekveneerimise protsess, mis põhineb ideel järjestamine sünteesi teel. Fred Sanger võitis oma teise Nobeli auhinna Sangeri sekveneerimise leiutamise eest 1977. aastal. Sangeri sekveneerimine oli peamine tehnoloogia, mida kasutati genoomsete andmete järjestamiseks kuni 2000. aastate keskpaigani, mil tehnoloogia asendati teise põlvkonna sekveneerimistehnoloogiaga. Mõlemad sekveneerimistehnikad on omavahel seotud, kuna mõlemad kasutavad sünteesitehnikaga sekveneerimist, kuid teise põlvkonna sekveneerimine paralleelselt Sangeri sekveneerimisega, mille tulemuseks on kulude ja kiiruse osas umbes 6 suurusjärgu suurenemine.

Me vaatame järjestamist arvutuslikust vaatenurgast ja me peame tehnoloogiast natuke aru saama, et motiveerida seda, mida me teeme. Järgnevalt proovime vastata järgmistele 3 küsimusele.

  1. Kuidas saame Sangeri sekveneerimise ja teise põlvkonna sekveneerimise vahel 6 suurusjärku parandada?
  2. Kuidas vead sisse tuuakse? Kõigil mõõtmistel on vigu ja nende vigade põhjused sõltuvad tehnoloogiast.
  3. Miks on lugemise pikkus piiratud? Üks järjestamise suurimaid arvutuslikke väljakutseid on see, et kuigi huvipakkuv jada on väga pikk (& gt 1M bp), on saadud andmed väga lühikesed (

Sekveneerimine sünteesi abil

Sünteesi teel järjestamine kasutab ära asjaolu, et tavaliselt kahekordse heeliksi kujul olevad DNA ahelad jagunevad mitoosi tõttu lahku ja iga ahel kopeeritakse. Sanger leidis nutika viisi, kuidas teisendada järjestamisprobleem massi mõõtmise probleemiks.

Eespool mainisime, et DNA polümeraas kasutab uue ahela sünteesimiseks loomulikult dNTP -sid. Sünteesiprotsess toimub väga kiiresti, mistõttu on sünteesi ajal raske igasuguseid mõõtmisi teha. Sanger sai sellest probleemist üle, mõeldes välja viisi sünteesi lõpetamiseks, kasutades dNTP -de modifitseeritud versiooni ddNTP -d (dideoksünukleotiidtrifosfaadid). DNA polümeraas võib järjestuse külge kinnitada ddNTP nagu dNTP -de puhul, kuid see ei saa ddNTP -ga midagi kinnitada. Teisisõnu, ddNTP kinnitumine peatab DNA molekuli replikatsiooni.

Tähistame A, C, G ja T -le vastavaid ddNTP -sid kui A*, C*, G*ja T*. Kui sisestame katsesse väikese koguse ühte tüüpi ddNTP -d (nt T*), siis reaktsioonide lõppedes jääb meile: 1. väike protsent ahelaid sisaldavaid ahelaid malli A -dele vastavates kohtades ja 2 suur osa ahelaid, mis sisaldavad ainult tavalisi dNTP -sid. Seda protseduuri tuntakse kui ahela lõpetamise meetod. Kirjeldame nüüd Sangeri sekveneerimisprotseduuri:

Esmalt kopeerime järjestust, kasutades meetodit, mida nimetatakse polümeraasi ahelreaktsiooniks (PCR), mis kasutab ära ka DNA replikatsiooni, et DNA kogust eksponentsiaalselt suurendada. Eeldame, et pärast PCR -tsüklite läbimist saame molekuli esialgse koguse korda. PCR suurendab oluliselt bioloogilise materjali kogust.

Proovi kuumutamisel eraldame need kaks kiudu. Ühte ahelat kasutatakse malli kiud või niit, millele uued alused kinnitatakse.

Lisame katseklaasi DNA malli ahela koos vabalt hõljuvate dNTP-de ja mõne modifitseeritud ddNTP-ga (1% nukleotiididest). Kõik ddNTP -d on sama tüüpi. Lisame ka a praimer või lühike jada, mis kinnitub huvipakkuva ahela algusesse ja alustab kogu replikatsiooniprotsessi.

Me filtreerime välja järjestused, mis lõpevad ddNTP -dega, kasutades meetodit, mida nimetatakse geelelektroforeesiks. See meetod kasutab asjaolu, et DNA molekulil on laeng. Pannes DNA proovi geelisse ja indutseerides geeli kohale elektrivälja, saame eraldada erineva massiga kiud (suuremad ahelad liiguvad aeglasemalt).

Mõõdame isoleeritud kiudude massi. Seda saab teha kas nukleotiidide radioaktiivse märgistamisega ja taseme või radioaktiivsuse mõõtmisega või lisades nukleotiididele fluorestseeruvaid silte ja mõõtes kiirgava valguse tugevust (st pildistades).

Allolev joonis illustreerib lihtsat näidet, mis näitab Sangeri sekveneerimise protsessi.

Me kombineerime need järjestuse saamiseks

A C G T
30.0 48.2 56.7 86.3
61.3 99.3
74.4

Nende nelja sorteeritud loendi ühendamine annab meile aluseks oleva järjestuse. Näites saame

30,0 - A
48,2 - C
56,7 - G
61,3 - A
74,4 - A
86,3 - T.
99,3 ° C

andes meile järjekorra ACGAATC.

Sangeri sekveneerimise piirangud

Sangeri sekveneerimine töötab järjestuste puhul, mille pikkus on umbes 700 bp. See lugemispiirang tuleneb asjaolust, et jada pikkuse kasvades muutub järjestikuse massi ja pikkuse jada massi eristamine üha raskemaks. Selle nägemiseks pange tähele, et 0,1% tolerants mõõtmisel muudaks võimatuks eristada pikkuse 1000 jada pikkusest 1001 isegi siis, kui kõigil alustel oleks sama molekulmass. Sellised vead massi mõõtmisel on ka Sangeri järjestuse vigade põhjus, kuigi veamäär on umbes 0,001%.

Lisaks on Sangeri sekveneerimine aeglane (väikese läbilaskevõimega), kuna massi mõõtmise protsess on aeganõudev. Sangeri sekveneerimine võimaldas teadlastel järjestada umbes 3000 alust nädalas. Üks peamisi põhjuseid, miks protseduur on aeglane, on see, et see nõuab paljude molekulide massi mõõtmist, mis on kulukas protsess. Sangeri sekveneerimiseks kasutatavad seadmed on näidatud allpool

Illumina sekveneerimine

Teise põlvkonna sekveneerimine, mille rajajaks oli Illumina, teeb ülaltoodud Sangeri protsessis mõned muudatused. Järjestusprotseduur paralleelib samuti protsessi, suurendades dramaatiliselt läbilaskevõimet, vähendades samal ajal hinda.

Illumina saavutab paralleelsuse, käivitades korraga mitu sünteesikatset. Kõik paljud malli ahelad on ankurdatud kiibile ja sünteesiprotseduuri ajal on saadaval ainult fluorestseeruvate siltidega ddNTP -d (dNTP -d puuduvad). Iga ddNTP tüüp on märgistatud nii, et see kiirgab erinevat lainepikkust või värvi. Kuna ddNTP -d peatavad sünteesi, sünkroonitakse uute ahelate süntees. Kõik uued ahelad on iga sünteesitsükli lõpus sama pikkusega, mille järel tehakse kiibist pilt. Neid pilte analüüsitakse seejärel baashelistaja tarkvara abil, et tuvastada (või helistada) komplementaarseid nukleotiide. Baaskõnet arutatakse üksikasjalikumalt järgmises loengus. Ahela lõpetamise alistamiseks kasutab Illumina järjestus pöörduv lõpetamine. Sekveneerimisprotsess tutvustab ensüümi, mis võib pärast sidumist muuta ddNTP tavaliseks dNTP -ks, võimaldades sünteesireaktsioone püsivalt peatada.

Tagamaks piisava valguse eraldumist nii, et ddNTP signaalid oleksid tuvastatavad, kloonitakse kõik matriitsiahelad, mille tulemusel sünteesitakse sama ahela klastrid üheaegselt. Pöörduva lõpetamise tõttu eemaldab Illumina sekveneerimine vajaduse masside mõõtmiseks. Vastupidiselt ülaltoodud Sangeri sekveneerimiseks vajalikule geelelektroforeesiprotseduurile on alloleval joonisel näidatud Illumina sekveneerimisel kasutatud klaasplaat. Illumina sekveneerimine võib järjestada miljardeid malli ahelaid samaaegselt, mis suurendab oluliselt läbilaskevõimet.

Vigu Illumina järjestuses tekivad ajaetappide tõttu, kus ddNTP ei seostu mõne järjestusega ja seega loetakse sama alust kaks korda. Lisaks on lahuses endiselt dNTP -sid ja seetõttu võib aeg -ajalt sünteesitava ahela külge kinnitada pigem dNTP kui ddNTP. Seejärel jätkab DNA polümeraas sünteesi, kuni see lisab erineva ddNTP. Sel põhjusel võib foto olla mürarikas, kuigi kõik klastri kiud on identsed.

Sangeri sekveneerimisnäitaja on tingitud Claire Margolisest. DNA replikatsiooni näitaja on võetud Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al, Raku molekulaarbioloogia. 4. väljaanne. Ülejäänud on võetud Ben Langmeadi märkmetest.


17.3 Kogu genoomi järjestamine

Selles jaotises uurite järgmisi küsimusi:

Ühendus AP ® kursuste jaoks

Jaotises esitatud teave ei kehti AP ® kohta. Siiski saate jaotises olevat teavet uurida valikulise või illustreeriva materjalina.

Õpetajate tugi

Vanemate meetoditega on patogeensete bakterite tuvastamine aeganõudev protsess, mis võib kesta päevi või nädalaid. Varem võib tuberkuloosibakterite tuvastamine kesta kuni kuus nädalat. DNA mikrokiibide väljatöötamine on võimaldanud kliinilistel laboritel lühendada seda aega tundideni, tagades identifitseerimise parema spetsiifilisuse. See on andnud arstidele teavet, mida nad vajavad, et patsiente kiiresti kõige tõhusamale antibiootikumravile saada, pakkudes paremat hooldust ja takistades nakkusetekitaja levikut rohkematele peremeesorganismidele.

Kuigi arstiteadustes on viimastel aastatel tehtud märkimisväärseid edusamme, on mõned arstid endiselt hämmingus ja nad kasutavad probleemi põhjani jõudmiseks kogu genoomi järjestamist. Terve genoomi sekveneerimine on protsess, mis määrab kogu genoomi DNA järjestuse. Kogu genoomi sekveneerimine on toore jõuga lähenemine probleemide lahendamisele, kui haiguse keskmes on geneetiline alus. Mitmed laborid pakuvad nüüd teenuseid tervete genoomide järjestamiseks, analüüsimiseks ja tõlgendamiseks.

Terve eksoomi sekveneerimine on odavam alternatiiv kogu genoomi sekveneerimisele. Eksoomide sekveneerimisel sekveneeritakse ainult DNA kodeerivad, eksoni tootvad piirkonnad. 2010. aastal kasutati terve eksoomi järjestamist noore poisi päästmiseks, kelle soolestikus oli mitu salapärast mädanikku. Lapsel tehti mitu jämesooleoperatsiooni ilma leevenduseta. Lõpuks viidi läbi kogu eksoomi sekveneerimine, mis näitas apoptoosi (programmeeritud rakusurma) kontrolliva raja puudust. Selle geneetilise häire ületamiseks kasutati luuüdi siirdamist, mis viis poisi paranemiseni. Ta oli esimene inimene, keda raviti edukalt kogu eksoomi sekveneerimisega tehtud diagnoosi alusel.

Teaduspraktika väljakutse küsimused sisaldavad selle jaotise materjaliga seotud täiendavaid testiküsimusi, mis aitavad teil AP -eksamiks valmistuda. Need küsimused käsitlevad järgmisi standardeid:
[APLO 2.23] [APLO 3.5] [APLO 3.20] [APLO 3.21]

Projektide järjestamisel kasutatavad strateegiad

Põhiline sekveneerimistehnika, mida kasutatakse kõigis tänapäevastes sekveneerimisprojektides, on ahela lõpetamise meetod (tuntud ka kui dideoksümeetod), mille töötas välja Fred Sanger 1970ndatel. Ahela lõpetamise meetod hõlmab üheahelalise matriitsi DNA replikatsiooni, kasutades praimerit ja tavalist deoksünukleotiidi (dNTP), mis on DNA monomeer või üksiküksus. Praimer ja dNTP segatakse väikese osaga fluorestsentsmärgistatud dideoksünukleotiididest (ddNTP). DdNTP -d on monomeerid, millel puudub hüdroksüülrühm (–OH) kohas, kuhu tavaliselt teine ​​nukleotiid kinnitub, moodustades ahela (joonis 17.12). Iga ddNTP on märgistatud erineva värvi fluorofooriga. Iga kord, kui ddNTP lisatakse kasvavasse komplementaarsesse ahelasse, lõpetab see DNA replikatsiooni protsessi, mille tulemuseks on mitu replikatsiooni DNA lühikest ahelat, millest igaüks lõpeb replikatsiooni ajal erinevas punktis. Kui reaktsioonisegu töödeldakse pärast üksikuteks ahelateks eraldamist geelelektroforeesiga, moodustavad mitmed äsja replitseeritud DNA ahelad erinevate suuruste tõttu redeli. Kuna ddNTP -d on fluorestsentsmärgistatud, peegeldab iga geeli riba DNA ahela suurust ja reaktsiooni lõpetanud ddNTP. Fluorofooriga märgistatud ddNTP-de erinevad värvid aitavad tuvastada sellesse asendisse kaasatud ddNTP. Geeli lugemine redeli iga riba värvi põhjal annab malli ahela järjestuse (joonis 17.13).

Varasemad strateegiad: haavlipüsside järjestamine ja paaritarkade lõppjärjestus

Haavlipüsside sekveneerimismeetodis lõigatakse mitu DNA fragmendi koopiat juhuslikult paljudeks väiksemateks tükkideks (mõnevõrra nagu see, mis juhtub ümmarguse haavlipadruniga, kui tulistatakse püssist). Seejärel sekveneeritakse kõik segmendid aheljärjestuse meetodil. Seejärel analüüsitakse arvuti abil fragmente, et näha, kus nende järjestused kattuvad. Ühtlustades kattuvad järjestused iga fragmendi lõpus, saab kogu DNA järjestust reformida. Suuremat järjestust, mis on kokku pandud kattuvatest lühematest järjestustest, nimetatakse kontiigiks. Arvestage analoogiana, et kellelgi on neli maastikupildi koopiat, mida te pole kunagi varem näinud, ega tea, kuidas see peaks ilmuma. Seejärel rebib inimene iga foto oma kätega üles, nii et igast koopiast on erineva suurusega tükid. Seejärel segab inimene kõik tükid kokku ja palub teil foto rekonstrueerida. Ühes väiksemas tükis näete mäge. Suuremas tükis näete, et sama mägi on järve taga. Kolmas fragment näitab ainult järve, kuid näitab, et järve kaldal on kajut. Seetõttu, vaadates nende kolme fragmendi kattuvat teavet, teate, et pildil on mägi järve taga, mille kaldal on kajut. See on põhimõte, mis põhineb tervete DNA järjestuste rekonstrueerimisel haavlipüsside järjestamise abil.

Algselt analüüsis haavlipüsside järjestamine kattuvuste tuvastamiseks ainult iga fragmendi ühte otsa. Sellest piisas väikeste genoomide sekveneerimiseks. Kuid soov järjestada suuremad genoomid, näiteks inimese geenid, viis kaheraudse jahipüssi sekveneerimise väljatöötamiseni, mida ametlikumalt nimetatakse paarisotsaliseks järjestamiseks. Paarisotsalise järjestuse korral analüüsitakse iga fragmendi mõlemat otsa kattumise suhtes. Paarisuunaline järjestamine on seetõttu tülikam kui haavlipüsside järjestamine, kuid järjestust on lihtsam taastada, kuna saadaval on rohkem teavet.

Järgmise põlvkonna järjestus

Alates 2005. aastast on laborites kasutatavad automatiseeritud sekveneerimismeetodid järgmise põlvkonna sekveneerimise all, mis on rühm automatiseeritud meetodeid, mida kasutatakse DNA kiireks sekveneerimiseks. Need automatiseeritud odavad sekveneerijad võivad ühe päeva jooksul genereerida sadu tuhandeid või miljoneid lühikesi fragmente (25 kuni 500 aluspaari). Need sekveneerijad kasutavad keerukat tarkvara, et saada läbi kõikide fragmentide korrastamise tülikas protsess.

Evolutsiooni ühendus

Järjestuste võrdlemine

Järjestuse joondamine on valkude, DNA või RNA paigutus, mida kasutatakse rakutüüpide või -liikide sarnasuse piirkondade tuvastamiseks, mis võib viidata funktsiooni või struktuuride säilimisele. Fülogeneetiliste puude ehitamiseks võib kasutada järjestuste joondamist. Järgmine veebisait kasutab tarkvaraprogrammi nimega BLAST (põhiline kohaliku joondamise otsingu tööriist).

Klõpsake jaotises „Basic Blast” nuppu „Nucleotide Blast”. Sisestage suur jaotis "Päringujärjestus" järgmine jada: ATTGCTTCGATTGCA. Leidke kasti alt väli "Liigid" ja tippige "inimene" või "Homo sapiens". Seejärel klõpsake "BLAST", et võrrelda sisestatud järjestust inimese genoomi teadaolevate järjestustega. Tulemuseks on see järjestus inimese genoomis üle saja koha. Kerige horisontaalsete ribadega graafika all alla ja näete iga sobiva tabamuse lühikirjeldust. Valige nimekirja ülaosast üks tabamustest ja klõpsake "Graafika". See viib teid lehele, mis näitab, kus järjestus on kogu inimese genoomis. Saate liigutada rohelise lipuna näiva liuguri edasi -tagasi, et vaadata järjestusi vahetult valitud geeni ümber. Seejärel saate valitud järjestusse naasta, klõpsates nuppu "ATG".

  1. Bakterivalk sarnaneb inimese valguga rohkem kui pärm.
  2. Bakterivalk sarnaneb pärmivalguga rohkem kui inimese valk.
  3. Pärmvalk sarnaneb rohkem inimese valguga kui bakterivalk.
  4. Bakteri- ja pärmvalk jagavad sarnast järjestust, kuid inimese valk pole kummagagi seotud.

Mudelorganismide täisgenoomi järjestuste kasutamine

Esimene täielikult sekveneeritud genoom oli bakteriviirus, bakteriofaag fx174 (5368 aluspaari), selle tegi Fred Sanger, kasutades jahipüsside järjestamist. Hiljem sekveneeriti mitmed teised organellide ja viiruste genoomid. Esimene organism, mille genoom sekveneeriti, oli bakter Haemophilus influenzae selle saavutas Craig Venter 1980ndatel. Pärmi genoomi sekveneerimisel tegi koostööd ligikaudu 74 erinevat laborit Saccharomyces cerevisiae, which began in 1989 and was completed in 1996, because it was 60 times bigger than any other genome that had been sequenced. By 1997, the genome sequences of two important model organisms were available: the bacterium Escherichia coli K12 and the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genomes of other model organisms, such as the mouse Musculus, puuviljakärbes Drosophila melanogaster, the nematode Caenorhabditis. elegans, and humans Homo sapiens are now known. A lot of basic research is performed in model organisms because the information can be applied to genetically similar organisms. A model organism is a species that is studied as a model to understand the biological processes in other species represented by the model organism. Having entire genomes sequenced helps with the research efforts in these model organisms. The process of attaching biological information to gene sequences is called genome annotation . Annotation of gene sequences helps with basic experiments in molecular biology, such as designing PCR primers and RNA targets.

Link õppimisele

Click through each step of genome sequencing at this site.

Review the Sanger sequencing method as pictured. Make a case for how deep sequencing offers an improvement on Sanger sequencing.

  1. Deep sequencing allows for much faster sequencing of short DNA strands as compared to Sanger sequencing, which reads only short sequences of DNA at a slow rate, and it avoids Sanger's issues with chain termination and separation.
  2. Sequence coverage is higher in Sanger sequencing as compared to deep sequencing.
  3. Sanger sequencing is suitable when there is only one nucleotide difference between chains, whereas deep sequencing is suitable when there is more than one nucleotide difference between chains.
  4. Sanger sequencing reads and sequences a genome multiple times, whereas deep sequencing accurately reads sequences the whole genome in a single time.

Uses of Genome Sequences

DNA microarrays are methods used to detect gene expression by analyzing an array of DNA fragments that are fixed to a glass slide or a silicon chip to identify active genes and identify sequences. Almost one million genotypic abnormalities can be discovered using microarrays, whereas whole-genome sequencing can provide information about all six billion base pairs in the human genome. Although the study of medical applications of genome sequencing is interesting, this discipline tends to dwell on abnormal gene function. Knowledge of the entire genome will allow future onset diseases and other genetic disorders to be discovered early, which will allow for more informed decisions to be made about lifestyle, medication, and having children. Genomics is still in its infancy, although someday it may become routine to use whole-genome sequencing to screen every newborn to detect genetic abnormalities.

In addition to disease and medicine, genomics can contribute to the development of novel enzymes that convert biomass to biofuel, which results in higher crop and fuel production, and lower cost to the consumer. This knowledge should allow better methods of control over the microbes that are used in the production of biofuels. Genomics could also improve the methods used to monitor the impact of pollutants on ecosystems and help clean up environmental contaminants. Genomics has allowed for the development of agrochemicals and pharmaceuticals that could benefit medical science and agriculture.

It sounds great to have all the knowledge we can get from whole-genome sequencing however, humans have a responsibility to use this knowledge wisely. Otherwise, it could be easy to misuse the power of such knowledge, leading to discrimination based on a person's genetics, human genetic engineering, and other ethical concerns. This information could also lead to legal issues regarding health and privacy.


The Human Genome Project

The Inimese genoomi projekt was an international research program involving over 1000 scientists. It was a publically funded project that began in the late 1980s, aiming to map and understand all the genes in the human genome. This can be carried out by determining the order (also called the jada) of all of the 3.2 billion nucleotides in the genome and characterizing the features of the DNA, specifically by figuring out which sequences code for protein-coding genes. The initial aim was to finish this project within 15 years. The first draft of 90% of the sequence was published in the journal Nature in 2001, the full sequence was published in 2004.

At the time, this was a hugely ambitious project. It was extremely costly (around $13 billion!), and at the time the technology was slow, meaning sequencing the first genome took about 13 years. There was also a lot of controversy surrounding the project, as it was wondered whether the cost of the project would outweigh the benefits. However, the success of the Human Genome Project is clear today. The information it provided and the innovation it sparked has greatly enhanced the way scientists work.

The Human Genome Project determined there are just over 20,000 human protein-coding genes. Interestingly, this is much less than the original estimate of 100,000 protein-coding genes based on the3 number of genes and the size of the genome in bacteria and worms. This differences reflects how complex the regulation of these genes has to be, in order to produce such an advanced organism.


Protseduur

The DNA to be sequenced is prepared as a single strand.

  • a mixture of all four normaalne (deoxy) nucleotides in ample quantities
    • dATP
    • dGTP
    • dCTP
    • dTTP
    • ddATP
    • ddGTP
    • ddCTP
    • ddTTP

    Because all four normal nucleotides are present, chain elongation proceeds normally until, by chance, DNA polymerase inserts a dideoxy nucleotide (shown as colored letters) instead of the normal deoxynucleotide (shown as vertical lines). If the ratio of normal nucleotide to the dideoxy versions is high enough, some DNA strands will succeed in adding several hundred nucleotides before insertion of the dideoxy version halts the process.

    At the end of the incubation period, the fragments are separated by length from longest to shortest. The resolution is so good that a difference of one nucleotide is enough to separate that strand from the next shorter and next longer strand. Each of the four dideoxynucleotides fluoresces a different color when illuminated by a laser beam and an automatic scanner provides a printout of the sequence.

    Here is a representative example of a DNA sequence (455 nucleotides of the lysU geen E. coli) which was generated by an automated sequencing device.
    (The image is courtesy of Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ.)


    DNA Sequencing: Changing the Landscape of Science and Biology

    Health Center researchers are at the forefront of new discoveries about the smallest molecules that have a major impact on human health.

    Health Center researchers are at the forefront of new discoveries about the smallest molecules that have a major impact on human health. (Shutterstock Photo)

    UConn researchers are at the forefront of new discoveries and understanding about the smallest molecules in the body that can have a momentous impact on human health.

    Brenton Graveley, professor of genetics and developmental biology. (Lanny Nagler for UConn Health Center)

    Brenton Graveley, professor of genetics and developmental biology at UConn Health Center and UConn’s Institute for System Genomics, and coauthor of a recent review article in Molekulaarne rakk with fellow UConn postdoctoral researcher Alex Plocik, explains how government-funded research consortia are using advances in DNA sequencing technology to unlock the mysteries surrounding diseases and disorders. By sharing this DNA sequence information with other researchers, new discoveries can be made even faster. Graveley is a lead investigator in one such government-funded research consortium, the ENCODE project.

    Sequencing involves mapping out the order of molecules within DNA, which is the blueprint or building blocks of life because it contains all of the genetic instructions needed to build and maintain an organism. “DNA sequencing has changed the whole landscape of science and biology,” Graveley says. “It’s exploding exponentially, and there’s no end in sight.”

    Understanding each individual’s DNA sequence allows doctors to develop treatments and cures specifically targeted to that person’s needs. “That’s the promise of personalized medicine,” he explains. “People may come in with totally unknown symptoms, and by sequencing their DNA we could use this information to treat them on an individual basis.”

    Today’s computer technology has made interpreting sequence data possible. In 2003, the complete human genome was sequenced through the U.S. government’s Human Genome Project, taking 13 years and costing about $3 billion. The project identified all of the more than 20,000 genes in human DNA and determined the sequences of the three billion chemical base pairs that comprise it.

    Health Center researchers are at the forefront of new discoveries about the smallest molecules that have a major impact on human health. (Shutterstock Photo)

    Today, this same sequencing can be done by a stand-alone laboratory in one day for several thousand dollars. “This research provides an opportunity for doctors to do testing on people with a certain disorder to study the genes which, when mutated, caused that disease,” he says. “It’s a game-changer.”

    The 1997 sci-fi film Gattaca imagined a world where people put their finger on a sensor and their entire DNA was analyzed on the spot. “The technology is in development right now to allow that to happen,” Graveley explains. “The science fiction that was dreamed up in a movie is essentially coming to be.”

    Earlier this year, the University of Connecticut and the State of Connecticut introduced Next Generation Connecticut, a plan to expand research, education and innovation in the science, technology, engineering and math (STEM) studies at UConn. Designed to put UConn at the forefront of technology and research, the program is expected to benefit the entire state by creating new jobs, innovations and start-up companies.

    “There is a large consortium of researchers who are generating rich data – so rich that we can’t analyze all aspects of it,” Graveley says. “What this means is that researchers can download and analyze data to make new discoveries about how biology works, without having to do any experiments. One of the goals of Next Generation Connecticut is to create these jobs and train people to have the knowledge to analyze data in ways that haven’t been done before.”

    UConn researchers are joining forces with genomics medicine experts at Jackson Laboratory, which is building a $1.1 billion research facility on the Health Center’s Farmington campus, to make further discoveries in the area of human genomics and to advance the computational tools for interpreting the data coming from this type of research. To accelerate research in this interdisciplinary field, UConn has brought together nine of its schools/colleges and the Jackson Laboratory to create the Institute for Systems Genomics.

    Graveley and Plocik teamed with other experts on a second review article recently published in the journal Kamber that covers a related topic involving techniques to splice RNA, which acts as a messenger to carry out instructions from DNA. It serves as another example of the wealth of genetics research and expertise at UConn.

    DNA sequencing can’t be done for every person quite yet, because the process is still expensive and because doctors need to be trained on how to use the information that sequencing provides, since the science is new to them, too. And there is still a large amount of information in DNA that researchers still don’t understand. But this is rapidly changing.

    “Sequencing technology will eventually apply to everyone,” Graveley says. “Somewhere down the road, maybe in 10 years or even longer, every person born will have their genome sequenced and have it be a permanent part of their medical record. This information can be used to figure out what’s wrong if they become sick and how they can be treated. This is an exciting time.”


    The Basics of Recombinant DNA


    So What Is rDNA?
    That's a very good question! rDNA stands for recombinant DNA. Enne
    we get to the "r" part, we need to understand DNA. Those of you with
    a background in biology probably know about DNA, but a lot of ChemE's haven't
    seen DNA since high school biology. DNA is the keeper of the all the information
    needed to recreate an organism. All DNA is made up of a base consisting
    of sugar, phosphate and one nitrogen base. There are four nitrogen bases,
    adeniin (A), tümiin (T), guaniin (G) ja tsütosiin (C). The nitrogen
    bases are found in pairs, with A & T and G & C paired together. The sequence

    of the nitrogen bases can be arranged in an infinite ways, and their structure is known as

    the famous "double helix" which is shown in the image below. The sugar used in

    DNA is deoxyribose. The four nitrogen bases are the same for all organisms. The

    sequence and number of bases is what creates diversity. DNA does not

    actually make the organism, it only makes proteins. The DNA is transcribed

    into mRNA and mRNA is translated into protein, and the protein then forms the

    organism. By changing the DNA sequence, the way in which the protein is

    formed changes. This leads to either a different protein, or an inactive protein.

    Now that we know what DNA is, this is where the recombinant comes in.
    Recombinant DNA is the general name for taking a piece of one DNA, and
    and combining it with another strand of DNA. Thus, the name recombinant!
    Recombinant DNA is also sometimes referred to as "chimera." By combining two or
    more different strands of DNA, scientists are able to create a new strand of DNA.
    The most common recombinant process involves combining the DNA of two
    different organisms.

    How is Recombinant DNA made?
    There are three different methods by which Recombinant DNA is made. Nemad on
    Transformation, Phage Introduction, and Non-Bacterial Transformation. Each
    are described separately below.

    Transformation
    The first step in transformation is to select a piece of DNA to be inserted
    into a vector. The second step is to cut that piece of DNA with a restriction
    enzyme and then ligate the DNA insert into the vector with DNA Ligase. The insert contains a selectable
    marker which allows for identification of recombinant molecules. An antibiotic
    marker is often used so a host cell without a vector dies when exposed to a certain
    antibiotic, and the host with the vector will live because it is resistant.

    The vector is inserted into a host cell, in a process called transformation. Üks
    example of a possible host cell is E. Coli. The host cells must be specially
    prepared to take up the foreign DNA.

    Selectable markers can be for antibiotic resistance, color changes, or any other
    characteristic which can distinguish transformed hosts from untransformed hosts.
    Different vectors have different properties to make them suitable to different
    rakendusi. Some properties can include symmetrical cloning sites, size, and
    high copy number.

    Non-Bacterial Transformation
    This is a process very similar to Transformation, which was described above. The
    only difference between the two is non-bacterial does not use bacteria such as E. Coli
    for the host.

    In microinjection, the DNA is injected directly into the nucleus of the cell being
    ümber kujundatud. In biolistics, the host cells are bombarded with high velocity
    microprojectiles, such as particles of gold or tungsten that have been coated
    with DNA.

    Phage Introduction
    Phage introduction is the process of transfection, which is equivalent to transformation,
    except a phage is used instead of bacteria. In vitro packagings of a vector is used.
    This uses lambda or MI3 phages to produce phage plaques which contain recombinants.
    The recombinants that are created can be identified by differences in the
    recombinants and non-recombinants using various selection methods.


    How does rDNA work?
    Recombinant DNA works when the host cell expresses protein from the recombinant genes.

    A significant amount of recombinant protein will not be produced by the host unless expression
    factors are added. Protein expression depends upon the gene being surrounded by
    a collection of signals which provide instructions for the transcription and translation
    of the gene by the cell. These signals include the promoter, the ribosome binding
    site, and the terminator. Expression vectors, in which the foreign DNA is inserted,
    contain these signals. Signals are species specific. In the case of E. Coli, these

    signals must be E. Coli signals as E. Coli is unlikely to understand the signals of

    human promoters and terminators.

    Problems are encountered if the gene contains introns or contains signals which act
    as terminators to a bacterial host. This results in premature termination, and the recombinant
    protein may not be processed correctly, be folded correctly, or may even be degraded.

    Production of recombinant proteins in eukaryotic systems generally takes place in
    yeast and filamentous fungi. The use of animal cells is difficult due to the fact
    that many need a solid support surface, unlike bacteria, and have complex growth
    needs. However, some proteins are too complex to be produced in bacterium,

    so eukaryotic cells must be used.


    Why is rDNA important?
    Recombinant DNA has been gaining in importance over the last few years, and
    recombinant DNA will only become more important in the 21st century as genetic

    diseases become more prevelant and agricultural area is reduced. Below are

    some of the areas where Recombinant DNA will have an impact.

    • Better Crops (drought & heat resistance)
    • Recombinant Vaccines (ie. Hepatitis B)
    • Prevention and cure of sickle cell anemia
    • Prevention and cure of cystic fibrosis
    • Production of clotting factors
    • Production of insulin
    • Production of recombinant pharmaceuticals
    • Plants that produce their own insecticides
    • Germ line and somatic gene therapy


    What does the future hold?
    Now that we've figured out the basics behind what Recombinant DNA are, it's
    time to look at how Recombinant DNA will impact the future. Which industries
    and fields will be shaped by rDNA? How will rDNA effect the health and
    lifestyles of RPI students in the next generation? Click over to our
    rDNA Impact Statement to find out the answer!

    Pop Quiz Time!
    To help you determine how well you know Recombinant DNA, we
    have generously decided to provide you with a basic quiz that even a
    senior ChemE should be able to do. Be sure and look over the additional
    information provided below, because these questions could be tricky! Kõik
    the information needed to answer the questions can be found on this page,
    or the associated pages. When you're ready, click below.

    Lisainformatsioon
    The information presented above is only an introduction to the wonders of
    Recombinant DNA. In order to fulfill your desire for knowledge, Matt and
    Beth have scoured the web for the best websites with in-depth knowledge
    concerning rDNA. You will find the links below and a brief
    description of what the page describes. Nautige!

    Recognition Sequences for frequently used restriction endonucleases.

    Information about human proteins that have been synthesized from eukaryotic and bacteria genes.

    Information about gene addition projects that have been done with plants.

    Information about gene subtraction projects that have been done with plants.

    Basic information about what DNA is

    A SHOCKWAVE application illustrating DNA replication

    A video that illustrates protein synthesis

    Information about how gene splicing differs from conventional agriculture

    Information about the merits of agricultural gene splicing

    Information about treating genetic diseases in the womb

    A Question and Answer about gene therapy

    The Recombinant DNA chapter of an online textbook

    A Recombinant DNA problem set and tutorial

    The NIH Guidelines for research involving Recombinant DNA

    An online textbook covering the protocols for Recombinant DNA

    A clearinghouse of links concerning Clinical Trials

    Information about gene therapy for human patients

    Recombinant DNA and the synthesis of human insulin

    A repository of information concerning Medical Biotechnology

    Created by Matthew Kuure-Kinsey and Beth McCooey for Biochemical Engineering Fall 2000


    Research advances emerging DNA sequencing technology

    In this illustration, a single-stranded DNA molecule moves through a nanopore. The nanopore is about 2 nanometers (nm) in diameter. By comparison, a strand of human hair is 80,000 to 100,000 nm wide. A water shell (blue) surrounds the DNA strand. Credit: University of Texas at Dallas

    Nanopore technology shows promise for making it possible to develop small, portable, inexpensive devices that can sequence DNA in real time. One of the challenges, however, has been to make the technology more accurate.

    Researchers at The University of Texas at Dallas have moved closer toward this goal by developing a nanopore sequencing platform that, for the first time, can detect the presence of nucleobases, the building blocks of DNA and RNA. The study was published online and is featured on the back cover of the April print edition of the journal Electrophoresis.

    "By enabling us to detect the presence of nucleobases, our platform can help improve the sensitivity of nanopore sequencing," said Dr. Moon Kim, professor of materials science and engineering and the Louis Beecherl Jr. Distinguished Professor in the Erik Jonsson School of Engineering and Computer Science.

    Currently, most DNA sequencing is done through a process that involves preparing samples in the lab with fluorescent dye and using lasers to determine the sequence of the four nucleobases, the fundamental units of the genetic code: adenine (A), cytosine (C), guanine (G) and thymine (T). Each nucleobase emits a different wavelength when illuminated, allowing scientists to determine the sequence.

    In nanopore sequencing, a DNA sample is uncoiled, and the hairlike strand is fed through a tiny hole, or nanopore, typically in a fabricated membrane. As it moves through the nanopore, the DNA strand disturbs the electrical current flowing through the membrane. The current responds differently based on the characteristics of a DNA molecule, such as its size and shape.

    "The electrical signal changes as the DNA moves through the nanopore," Kim said. "We can read the characteristics of the DNA by monitoring the signal."

    One of the challenges in advancing nanopore sequencing has been the difficulty of controlling the speed of the DNA strand as it moves through the nanopore. The UT Dallas team's research focused on addressing that by fabricating an atomically thin solid-state—or nonbiological—membrane coated with titanium dioxide, water and an ionic liquid to slow the speed of the molecules through the membrane. The water was added to the liquid solution to amplify the electrical signals, making them easier to read.

    The next step for researchers will be to advance the platform to identity each nucleobase more quickly. Kim said the platform also opens possibilities for sequencing other biomolecules.

    "The ultimate goal is to have a hand-held DNA sequencing device that is fast, accurate and can be used anywhere," Kim said. "This would reduce the cost of DNA sequencing and make it more accessible."


    Vaata videot: Introducción a la secuenciación de ADN parte 1 (Jaanuar 2022).